Molekulinėje biologijoje geras buferio pasirinkimas ir pasirengimas skirtingiems DNR išskyrimo etapams gali būti skirtumas tarp judėjimo į baltymų ekspresiją arba kito maxi-prep rinkinio atidarymo pradžios. Nepaisant jų svarbos, buferiniai receptai dažnai yra tik tie receptai, parašyti be paaiškinimų ar skirtingų komponentų pagrindimo. Vienas iš tokių buferių yra gliukozės-tris-EDTA arba GTE buferis.
$config[code] not foundKas yra GTE?
GTE naudojamas bakterinių ląstelių granulių suspendavimui prieš lizuojant (atidarant) ląsteles ir surenkant plazmidės DNR viduje. Lizocimas, kuris minkština ląstelių membranas, dažnai pridedamas kartu su GTE buferiu. Norint gauti gerų DNR derlių, šio etapo metu pasiekti vienodą visuotinių ląstelių suspensiją, kad vėliau į ląstelę patekęs lizės tirpalas galėtų patekti į visas ląsteles. GTE yra sukurta taip, kad taip pat užtikrintų stabilią DNR aplinką.
Gliukozė
50 mg (milimolinis) gliukozės cukrus pridedamas prie GTE buferio, siekiant išlaikyti osmoliarumą, kai tirpalo koncentracija už ląstelių yra artima ląstelių viduje. Tai užkerta kelią ankstyvai ląstelių lizei, kuri gali sukelti mažesnį DNR derlingumą dėl agregacijos ir skaidymo. Kiti buferio komponentai taip pat prisideda prie tirpalo osmoliškumo, bet gliukozė, kuri yra ne elektrolitas, yra geras pasirinkimas, nes jis netrukdo tirpalo buferinėms savybėms.
PH stabilumas
Tris yra trumpas tris (hidroksimetil) aminometano pavadinimas, kuris yra labai dažnas pH buferis. GTE buferio atveju rūgšties druska (Tris-HCl) pridedama prie buferio, esant 25 mM koncentracijai. Tai užtikrina, kad tirpalo pH būtų beveik fiziologiniame 8,0, idealus pH, kad būtų išvengta plazmidės DNR rūgšties hidrolizės ir kitų ląstelių komponentų nepageidaujamų šalutinių reakcijų.
EDTA apsaugo nuo DNR degradacijos
EDTA, arba etilendiaminetraacto rūgštis, užfiksuoja arba „chelato“ metalinius jonus iš tirpalo, neleidžiant jiems dalyvauti nepageidaujamose šalutinėse reakcijose. GTE buferyje EDTA pridedama 10 mM. Jo pagrindinis tikslas yra buferyje suapvalinti laisvąjį cinką, magnį ir kalcį, taip užkertant kelią DNR degradacijai tam tikrais būdais, kuriems reikia šių metalų.
Kai kurie svarbūs patarimai
Laikykite savo GTE buferį šaltu ir nedideliais kiekiais, kad būtų išvengta nenumatytų bakterijų augimo. Cukrus ir kontroliuojamas pH užtikrina didelę augimo terpę. Visada naudokite išgrynintą vandenį. Vandentiekio vanduo gali turėti metalų jonų perteklių iš vamzdžių, o tai gali užkirsti kelią EDTA gebėjimui užfiksuoti. Jei įtariate, kad jūsų mėginyje yra trukdančių RNR, į GTE buferį pridėkite RNazė A 100 mikrogramų mililitre, kad pašalintumėte problemą.
